Od chvíle, ako sa Peter Parker (Tobey Maguire) rozhodol opustiť svoju dlhoročnú lásku Mary Jane Watsonovú (Kirsten Dunstová), aby sa mohol v kostýme Spider-Mana aj naďalej zodpovedne venovať svojmu povolaniu superhrdinu, uplynuli dva roky. Jeho túžba po milovanej Mary Jane však postupom času len vzrastá, a preto sa teraz pohráva s myšlienkou, že by sa tajného života superhrdinu na dôkaz svojej lásky zriekol. Mary Jane sa medzitým rozhodla ísť svojou cestou - vydala sa na dráhu filmovej herečky a v jej živote figuruje nový muž.
Peter má problémy aj so svojím najlepším priateľom Harrym Osborneom (James Franco). Ich kamarátsky vzťah čoraz väčšmi zatieňuje Harryho nenávisť voči Spider-Manovi, ktorého obviňuje zo smrti svojho otca. Keď sa zdá, že to už horšie ani nemôže byť, ocitne sa Peter tvárou v tvár mocnému Dr. Ottovi "Octopusovi" Octaviovi (Alfred Molina) - diabolskému netvorovi s dvoma pármi smrtiacich chápadiel, ktorý mu je viac než dôstojným protivníkom. Ak má jeho vyčíňanie zastaviť, musí sa naučiť žiť so svojím osudom a využiť všetky svoje schopnosti, ktoré sú mu darom i kliatbou zároveň.

Alfred Molina, rodným menom Alfredo Molina je britsko-americký herec španielsko-talianskeho pôvodu. Ide o všestranného umelca, ktorý vie dobre zahrať všetky herecké žánre a polohy, od shakespearovských dramatických rolí až po role záporné.

Daniel J. Gillies je novozélandský herec a režisér. Známy je najmä ako Elijah Mikaelson zo seriálov Upírske denníky a The Originals. Stvárnil postavu Dr. Joela Gorana z TV seriálu Saving Hope.

Elizabeth Banks, vlastným menom Elizabeth Irene Mitchell, je americká herečka, režisérka, producentka a scenáristka. Je známa vďaka úlohe Effie Trinket vo filmoch Hunger Games v rokoch 2012 až 2015.

James Edward Franco je americký herec, režisér, scenárista, producent, maliar a model. Začal hrať počas v polovici 90. rokov, kedy sa objavil v krátkom televíznom seriáli Freaks and Geeks ako aj v niekoľkých tínedžerských filmoch.

Kirsten Caroline Dunstová je americká herečka. Debutovala v krátkom filme Woodyho Allena, Oedipus Wrecks, ktorý bol súčasťou filmovej antológie Poviedky z New Yorku. Medzinárodnú popularitu si vyslúžila najmä rolou Mary Jane Watsonovej vo filmoch o Spider-Manovi.

Tobey Maguire je americký herec. Svoju hereckú kariéru začal v 80. rokoch 20. storočia rokoch a odvtedy sa preslávil hlavne postavou Petera Parkera v sérii filmov Spider-Man v rokoch 2002 – 2007.

Aasif Mandvi, Anne Betancourt, Bill Calvert, Bill Nunn, Bonnie Somerville, Brendan Patrick Connor, Brent Briscoe, Brianna Lynn Brown, Bruce Campbell, Chloe Dykstra, Christine Estabrook, Cindy Cheung, Claudia Katz Minnick, Cliff Robertson, Dan Callahan, Dan Hicks, Daniel Dae Kim, Donnell Rawlings, Dylan Baker, Elya Baskin, Elyse Dinh, Emily Deschanel, Garrett Warren, Grant Curtis, Gregg Edelman, Hal Sparks, Halla, Jack Wetherall, Jimmy Star, Joanne Baron, Joel McHale, Joey Diaz, John Landis, John Paxton, Joy Bryant, Julia Max, Lou Volpe, Louis Lombardi, Mageina Tovah, Marc John Jefferies, Michael Urbanski, Peter Allas, Peter McRobbie, Phil LaMarr, Reed Diamond, Roshon Fegan, Sam Raimi, Scott Spiegel, Spencer List, Stan Lee, Taylor Gilbert, Ted Raimi, Timothy Patrick Quill, Tom Carey, Troy Metcalf, Vanessa Ferlito, Willem Dafoe